评价和比较各类抗氧化剂 DPPH 自由基清除活性的指标包括 DPPH自由基清除率、半数抑制浓度( IC50) 、抗氧化剂活性指数、Trolox 等值抗氧化活性、抗坏血酸等值抗氧化活性等[25]。

此外本实验提供了一种高抗氧化性菌株的高通量筛选方法，取待测样品，加入无菌水，10倍梯度稀释，振荡，取上清液涂布于固体培养基中培养至长出单菌落，即为待筛选菌株；在无菌条件下，取待筛选菌株，接种于含有液体培养基的多孔细胞培养板中，活化3代后，待用；取等体积的DPPH无水乙醇溶液和活化后的菌液于多孔细胞培养板中，混匀后黑暗环境反应，离心，取上清液备用；取上清液加到多孔板中，用酶标仪在517nm处测抗氧化性，以VC当量计，VC当量高的即为高抗氧化性菌株。本发明的方法综合多孔板培养、发酵，多孔板-酶标仪相耦合快速检测，效率可提高约100-159倍，为高抗氧化

1.4 酪氨酸酶的概述

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一种含铜的氧化还原酶,它广泛存在于动植物和微生物中,与生物体合成色素直接相关[26]。 酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶,而黑色素异常生成造成的色素沉着是动物衰老及果蔬腐败的重要表象。哺乳动物体内黑色素分优黑素(Eumelanins)和褐黑素(Phaeomelanins)两种,前一种为棕黑色,后一种为红棕色,两种色素的比例不同造成毛发皮肤颜色的不同.黑素的生物合成是一个由酪氨酸酶(Tyrosinase)催化体内酪氨酸(Tyr)羟化而启动一系列生化反应生成两种黑色素的过程。这一过程最早为Raper所描述,并由Mason验证并补充,Seo S Y等曾总结酪氨酸酶在催化黑色素形成的作用。黑色素生物合成过程可大体分为两个阶段第一阶段是由酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成L-3,4-二羟基丙氨酸(L-多巴)(单酚酶活性),并进一步将L-多巴氧化生成多巴醌(二酚酶活性).这两步反应都是由酪氨酸酶催化的,酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能.第二阶段从多巴醌(DOPAquinon)为原料从两个不同途径分别生成真黑素和褪黑素的过程.真黑素生成,多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色素,极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素,多巴色素经异构、脱羧生成5,6-二羟基吲哚(DHI),5,6-二羟基吲哚。酪氨酸酶主要参与两个反应过程: 催化 L2酪氨酸羟基化转变为 L2多巴和氧化 L2多巴形成多巴醌 ,多巴醌经一系列反应后,形成黑色素。酪氨酸酶在生物体中具有重要的生理功能。同时 ,它也与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关 ,并与昆虫的蜕皮和果蔬的褐化有很大关系哺乳动物酪氨酸酶催化产生的黑色素被分泌进入到表皮和毛发的角质细胞中 ,使体表着色 ,从而起保护皮肤和眼睛、抵御紫外线的辐射和防止内部组织过热等作用[27]。哺乳动物酪氨酸酶常见于黑素细胞中 ,黑素细胞是存在于皮肤 ,发囊和眼睛中并产生色素的高度特异性的细胞。酪氨酸酶功能减退或缺失时 ,即会影响黑色素的代谢。

酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶.近年来的研究表明,黑色素在防紫外线辐射、清除自由基、作为无定形半导体、化妆品、以及生物杀虫剂的光保护剂等方面都具有广阔的应用前景。酪氨酸酶的抑制剂可被作为化妆品中的增白剂如熊果甙和曲酸,因此可以以酪氨酸酶作为研究对象寻找更好的美白剂。同时,酪氨酸酶激活剂如一些中药的提取物则被用于治疗白化病和白癫疯等疾病。

鉴于酪氨酸酶与黑色素的产生紧密相关，因此在本实验中选用酪氨酸酶实验来作为一个判断酵母菌美白度的指标。由于酪氨酸酶在黑色素的生物合成中扮演了重要角色，研究者对其抑制剂的作用机制进行了比较系统的研究，并以这些研究的成果为基础开发了一系列美白剂。在化妆品的生产上，酪氨酸酶抑制剂被广泛作为皮肤美白剂。在酪氨酸酶的底物酪氨酸和多巴存在的情况下，通过检测多巴色素的生成情况可以判断酪氨酸酶抑制剂抑制作用的强弱。研究表明，酪氨酸酶抑制剂的作用机制可以归纳为以下几点： 减少多巴醌的生成，清除多巴醌，与底物竞争酪氨酸酶，非特异性的酶灭活剂和特异性的酪氨酸酶灭活剂，以及特异性的酪氨酸酶抑制剂。具有以上6种作用机制的化合物中，只有特异性的酪氨酸酶灭活剂和特异性的酪氨酸酶抑制剂能直接作用于酪氨酸酶，它们的抑制作用相对较强，而其他几类化合物都是间接作用于酪氨酸酶，抑制作用相对较弱。