Yoshida等[12]研究发现，在op/op基因突变小鼠的基因中，发现在CSF1的基因编码区内，有一个突变点，这个突变点导致蛋白质的合成提前终止，不能产生CSF1而造成骨豁硬化。有研究证明，骨豁硬化症可以用重组的CSF1进行治疗，CSF1对于破骨细胞前体的增殖、分化，都起到相当重要的作用[13-16]。

CSF1具有多种生物学功能，因此而受到生物界广泛的重视。临床上也反馈，CSF1在对破骨细胞的调节、肿瘤的治疗都有很重要的意义[17]。

通过这次实验，要证明北京义翘神州生物技术有限公司，生产出的CSF1单克隆抗体，具有良好的生物活性，并且在肿瘤治疗方面能起到积极疗效。

1.实验材料及试剂

1.1实验材料

M-NFS60:为依赖rhMCSF(recombination human MCSF)的小鼠粒白血病细胞株，购自美国ATCC公司。mCSF1抗体(mouse CSF1 Antibody)，mCSF1(mouse CSF1)，CSF1(CSF1)，来自义翘神州生物技术有限公司。

1.2实验仪器

表1实验仪器

名称 生产厂家 型号

东亚牌液氮容器 乐山东亚机电工贸有限公司制造 yDS-100-200C

CO2培养箱 Thermo Fisher Scientific 3112

紫外分光光度计 Thermo ND-2000C

酶标仪 Thermo MK3

倒置显微镜 尼康仪器(上海)有限公司 XDS-2B

生物安全柜 上海瑞仰净化装备有限公司 BBS2A2-1612

混旋器 海门其林贝尔 QL-905

1.3实验试剂

1.3.1 培养基

1640培养基，义翘神州生物技术有限公司提供。

胎牛血清(FBS)，从Gibco公司购买，-20℃保存，使用前灭活，灭活为了除掉血清补体里的敏感物质，减少支原体污染的风险。

M-NFS60培养基(1640+10%FBS+0.05mM β-ME+62ng/mL CSF1)，取10mL的FBS加到90mL的1640培养基，再加入体积100μL 50mMβ-巯基乙醇和62ng/mL 人CSF1。

实验培养基(1640+10%FBS+0.05mM β-ME)，取10mL的FBS加到90mL的1640培养基，再加入体积100μL 50mMβ-巯基乙醇，不加CSF1因子。此实验培养基也作为样品的稀释液。

1.3.2 显色剂

0.4%台盼兰，称0.4g台盼蓝的粉末加入到三角烧瓶中，搅拌溶解6h以上，待其充分溶解后，用0.20µm滤膜过滤除菌，室温保存即可。

WST-8显色液，分别称取0.0045g 1-methoxy PMS，0.2895g WST-8和0.8776g的氯化钠，加入100mL超纯水溶解后，用0.20µm的滤膜过滤除菌之后分装，-20℃条件下避光保存。

1.3.3 EL1SA相关试剂

PBS，洗涤液，缓冲液，试剂稀释液，AB显色液，终止液。

2.实验方法

2.1 M-NFS60细胞培养

2.1.1细胞复苏

把水浴锅温度调到37℃，准备复苏细胞。从液氮库里取出M-NFS60细胞，放到37℃水浴锅进行解冻。解冻后从水浴锅中取出，用酒精喷洒后拿到生物安全柜中进行操作。把细胞悬液移到一个15mL无菌离心管里，再加入4mL的M-NFS60培养基（1640+10%FBS+0.05mM β-ME+62ng/mL CSF1）。然后800rpm离心5min，丢掉上清，用5mL的M-NFS60培养基重悬，然后转移到T25中，放入5%CO2培养箱，恒温37℃进行培养。

2.1.2细胞计数

用移液管吸取少量细胞悬液，混匀后取100μL，再加入100μL台盼兰溶液，混匀后取两个10μL于细胞计数板。

细胞计数公式为：细胞数=方格的总细胞数/方格数×104×稀释的倍数。

2.1.3细胞传代

M-NFS60细胞的最佳接种密度是2.5×104cells/mL，根据计数得出的细胞密度，计算传代的倍数。用移液管吹吸混匀后，留下用于传代的细胞悬液，然后用M-NFS60培养基补到5mL。放到37℃ CO2培养箱继续培养。

2.1.4细胞冻存

配置细胞的冻存液(1640+10%FBS+0.05mM β-ME+62ng/mL CSF1 +5%DMSO)。取要冻存的细胞，在显微镜下观察后，把细胞移到15mL离心管，800rpm离心5min，弃上清，加入M-NFS60培养基重悬。用细胞计的数法，得到M-NFS60细胞的密度，通过计算，使细胞密度最终为1×106/mL。每个冻存管加1mL细胞冻存液，摆在冻存盒中，放到-80℃冰箱，第二天把细胞转到液氮灌保存。