2.2抗体UV检测

利用Thermo Nano Drop 2000C 分光光度计检测抗体成分。用pH为7.4的PBS作为标准样品，用移液枪吸取5μL PBS加到样品室，合盖子，读值，作为空白对照，用干净的纸擦掉样品室里的PBS，吸5μL的mCSF1 (51112-R017)加入样品室内，读取结果。核酸、蛋白和多聚体的最大吸收波长分别是260nm、280nm、320nm，为了检测抗体的成分，分别读取该样品在260nm、280nm、320nm处的OD值。

2.3竞争ELISA

用竞争ELISA的方法，检测mCSF1单克隆抗体与mCSF1R-Fch（受体）竞争结合mCSF1的作用。

包被：用CBS缓冲液把mCSF1稀释到0.2μg/mL，酶标板上每孔加入100μL，4℃过夜，包被完成。

洗板：用340μL/well 的TBST洗液进行洗板，洗1次板，拍干（注意：洗板时，一定不能使液体飞溅到板上，把板拍干）。

封闭：拍干之后，往板内加 340μL/well的 2% BSA，用保鲜膜包好，封闭1h。

洗板：用340μL/well 的TBST洗液进行洗板，洗3次之后拍干。

加样：用0.1% BSA的TBST样品稀释剂对样品进行稀释，得到20μg/mL，4μg/mL，0.8μg/mL的稀释样品，酶标板中每孔加入100μL，将mCSF1R-Fch稀释到0.2μg/mL，加入抗体孔中，假定样品稀释剂100μL/well加mCSF1R-Fch 0.2μg/mL孔是阳性孔，室温孵育1h。

洗板：用340μL/well 的TBST洗液进行洗板，洗3次之后拍干。

加二抗：把被辣根过氧化物酶标记好的C-his-R023稀释到0.5μg/mL。以100μL/well加入酶标板，用保鲜膜包好，室温孵育1h。

洗板：用340μL/well 的TBST洗液进行洗板，洗3次之后拍干。

显色：A+B显色液（1:1混合），每孔加入200μL，避光显色10min。

终止：2M H2SO4 50μL/well加入酶标板，终止反应后，用酶标仪读取OD450的读数。

2.4中和实验

2.4.1细胞接种

取培养好的M-NFS60细胞，800rpm离心5min后，弃掉上清，用实验培养基（1640+10%FBS+0.05mM β-ME）重悬，然后再800rpm离心5min，清洗3次，将CSF1洗掉，然后用实验培养基重悬。将重悬好的M-NFS60细胞，取样进行细胞计数。并计算M-NFS60细胞的细胞密度。将培养好的M-NFS60细胞接种到96孔板，根据计算好的细胞密度，计算出每孔10000的细胞量，以10k/well的密度接种细胞，每孔加50μL到96孔板，A行和H行为空白对照，不加细胞，每孔加入50μL的实验培养基，用封口膜封好后放在放入5%CO2培养箱，恒温37℃培养，2h后加样。

2.4.2样品稀释

采用实验培养基(1640+10%FBS+0.05mM β-ME)对0.929mg/mL的单克隆抗体样品进行稀释，稀释成40μg/mL（标记为S1），然后向下5倍梯度稀释成9个浓度，计作S2～S9。以50μL /孔的量加到于96孔板中，因为96孔板中每孔有50μL的细胞，所以S1～S9实际抗体终浓度则减少一倍，最终稀释浓度如表2。

表2 样品稀释表

Number S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9

mCSF1抗体Conc.(ng/mL) 20000 4000 800 160 32 6.4 1.28 0.256 0.051

2.4.3加样及补液

将96孔板取出，每孔加样50μL，每个稀释度用6个复孔。在空白对照组A行和H行中，每孔加50μL样品稀释液。设对照孔M和M'，每孔加50μL样品稀释液。随后在96孔板中第2-11列每孔补加10μL终浓度为5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL的mCSF1（注：在第1列和第12列中补加10μL/well的样品稀释液）