3、正向遗传学

3.1、如何筛选斑马鱼的时钟突变体

许多大规模的遗传筛选已成功地利用斑马鱼形成。涉及的化学诱变剂或逆转录病毒插入诱变的使用协议通常用于产生大量突变的鱼[5]。初步的关键步骤是建立一个强大的试验，可以通过一个大的规模试验，以确定特定的突变体的表型。因此，最早的研究，对斑马鱼的昼夜生物学主要是为了建立这样一种方法，可以用于对时钟突变体大规模的筛选的目的。从逻辑上讲，第一次调查集中在自发活动已成功利用在果蝇和老鼠的生理时钟输出。基于红外线光束的监控系统被用于坦克中。然而，它变得明显，对于孤立的成年鱼，即使在野生型鱼类种群，这些节奏是远离强大的，有显着的变化[9.39]。相反，自发活动的幼虫被证明是一个更强大的时钟检测。个别幼虫被放置在24孔板，然后自动视频分析系统被用来记录游明活动。从GE比在成人中看，幼虫表现出强劲的日活动节律有更少的个体间变异和遗传背景相似[39.40]。事实上，这种方法被成功地用于大规模的屏幕上的时钟突变的斑马鱼[41]。另一个时钟输出研究作为一个潜在的遗传筛选表型是褪黑激素的释放。在光/暗下胚胎发育（LD）周期，褪黑激素的释放是在大约24小时后受精（HPF）第一次被检测到，连同AANAT表达[19.42]。因此，它代表在开发过程中的第一个可检测的时钟输出之一。这可能为基因筛选的一个方便的基础上,提出了通过测量AANAT表达或褪黑激素重新从单个胚胎租用检测时钟输出。此外，成人的松果体褪黑素继续有节奏地综合的合成在文化中的光和时钟的依赖性的方式。使用流通过文化系统和自动馏分收集系统能够自动、准确地测量时间点的节奏从个体成年斑马鱼的松果体褪黑激素的释放[10.43]。虽然不一定适合大规模的分析，精确的方法进一步分析突变的另一个输出时钟的影响。

替代的方法已经设想的第一个转基因株系的荧光素酶报告基因的活性是由一个时钟调节启动子[44]。荧光素的加水量是足够生产一种生物发光信号，可以测量在一个闪烁计数器或摄像机为基础的检测。此外，胚胎和幼虫可以生存下去，因为体积小可以包含在一个96孔板中。该方法已成功地应用在其他模型中如果蝇和拟南芥，并提供替代性可能更快速的自动筛选[45]。确定了一个时钟突变体的表型，下一阶段是要找出突变的遗传位点的位置。在斑马鱼中，这些后续的“计划”步骤需要跨越突变到另一个遗传背景显示显著的多态性与应变在原来进行诱变。随后的分离的突变体的表型多态，微卫星标记方法用来映射到一个给定的连锁群的突变，然后随后精细映射到一个特定的区域或位点[5]。通常这种方法是直线向前的情况下，明确评价性现象的表型，可见在胚胎期解剖异常[4]。然而一个行为法如用于识别时钟突变在特殊情况下使得整个映射过程更加麻烦，在时钟节律的影响可能相对微妙。

3.2、斑马鱼的时钟突变

到目前为止，一个主要的正向遗传筛选已经完成，6500的突变基因的同等大小的基因组筛选显性突变影响的自发活动的昼夜节律[41]。八倍体纯合体能自行生产发育，半显性突变体被随后确定。在一个突变体，被缩短的自由运行的昼夜节律周期辨识、异亮氨酸突变为天冬酰胺在clock1a PAS结构域的确定。这种突变似乎与野生型蛋白相比提高了时钟介导转录激活[46]。另一个突变称为啤酒和石灰（滞后（2））（伦敦俗语时间！）还以缩短昼夜自由运行周期（0.7 h和1.3 h杂合子纯合子）[41]。这种突变不仅影响松果体的运动节奏也影响褪黑激素的生产节奏以及在温度这一节奏变化的敏感性。虽然突变基因的确切身份尚未确定，突变体7号染色体并没有影响任何已知的时钟基因[41]。这表明，这种无偏见的正向遗传学的方法仍然持有一定承诺，在脊椎动物的时钟机制能够识别新的元素。