1 材料与方法

1.1实验材料与仪器

1.实验仪器

七叶一枝花                   于周口市同和堂药店购买；

芦丁标准品                   国药集团化学制剂有限责任公司

E120 pH计                   梅特勒-托利多仪器设备（上海）有限公司

格兰仕微波炉                  广东格兰仕仪器有限公司

AR223CN电子天平             梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司

FW高速万能粉碎机            郑州市亚荣仪器有限公司

电热恒温鼓风干燥箱            上海一恒科学仪器有限公司

SHB-Ⅲ循环水式真空泵          郑州市亚荣仪器有限公司

732紫外可见分光光度计         上海元析仪器有限公司

广口瓶、容量瓶、细口瓶、锥形瓶、量筒、试管等若干。以上实验材料均是由周口师范学院生命科学与农学学院实验室提供。

1.2实验方法

1.2.1 七叶一枝花总黄酮粗提液的制备

选取干燥瓣状七叶一枝花，置于粉碎机中，在1500 r / min的转速下粉碎2 min，使其粉粹为粉末状后再过筛，取出置于广口瓶中备用。准确称取七叶一枝花10 g放于锥形瓶中，并以1∶15（mg/mL）的料液比加入到35%乙醇中，在室温中放置15 min后，将锥形瓶放置于微波炉中，加热时间为15 s；调节微波炉，使加热功率为1600 W，加热过后室温静置20 min，使溶液冷却；冷却结束后将溶液用抽滤机进行抽滤，并收集提取液，重复抽滤两次，合并收集来的三次滤液[4]。

1.2.2 七叶一枝花中总黄酮含量测定

将3次抽滤得到的滤液转置到200 mL的容量瓶中，用35 %的乙醇进行定容。取粗总黄酮提取液5 mL于10 mL容量瓶中，加入5 % 亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀静置6 min；之后加入10 % AL（NO3）3溶液1.0 mL，摇匀静置6 min后，加入5 % 氢氧化钠溶液3 mL，35 %乙醇稀释到刻度；溶液摇匀再静置15 min后，于紫外可见分光光度仪510 nm波长处测量其吸OD值[5]。测量三次，取其平均值。

以芦丁为标准品，用30%乙醇溶液微波溶解并定容至100 mL，从而得浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准液。分别取浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10mL容量瓶中，各加入5 % NaNO2溶液1.0 mL，摇匀静置6 min；之后分别加入10 % AL（NO3）3溶液1.0 mL，摇匀静置6 min，然后加5 % NaOH溶液3 mL，最后用30 %乙醇稀释到刻度，摇匀静置15 min，最后用紫外分光光度计于510 nm处测量OD值[6]。以纵坐标为OD值，横坐标为芦丁的含量（mg） 绘制标准曲线。

芦丁标准曲线方程为：A=13.193C-0.0013 （R2=0.9985）。式中其中A为所测吸光度值，C为提取液中总黄酮浓度mg/mL，R2为相关指数。将七叶一枝花总黄酮提取液稀释后按上述方法测定吸光值，根据芦丁标准曲线计算总黄酮的浓度。

1.2.3 乙醇-硫酸铵双水相萃取方法

称取一定量乙醇、硫酸铵、七叶一枝花总黄酮粗提液于小烧杯中，使双水相体系总体积为50.00mL，充分振荡使成相物质溶解，并调节体系pH，静置10min至两相分层，七叶一枝花总黄酮富集于双水相系统的上相中，测定相比R和七叶一枝花总黄酮的含量[7]。计算其分配系数K及萃取率Y，如下式：

R =V1 / V2

K =C1 / C2

Y =RK / (1+RK)

式中：V1为上相体积，mL；V2为下相体积，mL；C1为上相总黄酮的质量浓度，mg/mL；C2为下相总黄酮的质量浓度，mg/mL。

1.2.4 乙醇-硫酸铵双水相体系的最佳配比

通过改变乙醇质量分数（18 %、22 %、26 %、30 %、34 %）、硫酸铵质量分数（17 %、19 %、21 %、23 %、25 %）、pH（4、5、6、7、8）以及NaCl质量分数（1 %、2 %、3 %、4 %、5 %）确定双水相体系的组成。