摘要：纤维素材料是世界上最丰富的生物资源，纤维素可以转化为乙醇燃料，能够从根本上解决目前的能源危机问题，而纤维素酶在这一转化过程中起着关键的作用。本文将从四种能产生纤维素酶的芽孢杆菌WR2、WL11、SL16、LK1中筛选出特异性最强的纤维素酶基因，进行纯化回收并转化进入大肠杆菌质粒进行异源表达，用于研究纤维素酶的酶学性质。

关键词：纤维素酶；芽孢杆菌；大肠杆菌；异源表达；酶学性质

Escherichia coli expressing heterologous cellulose

Abstract: Cellulose material is the most abundant biological resources in the world, Cellulose can be converted to ethanol, can fundamentally solve the problem of the current energy crisis, and cellulase in this transformation process plays a key role. In this paper, four kinds of Bacillus subtilis WR2, WL11, LK1 and SL16 were selected to screen out the strongest specific cellulase genes. DNA recovery and transformed into e. coli heterologous expression plasmid, used to study the enzymatic properties of cellulase.

Key words: cellulase; Bacillus; Escherichia coli; heterologous expression；Enzymatic properties

目   录

摘要 1

Abstract 1

引言 1

1.材料与方法 2

1.1实验材料 2

1.1.1实验试材 2

1.1.2培养基 2

1.1.3主要试剂 2

1.2仪器与设备 3

1.3试验方法 3

1.3.1提取纤维素酶基因 3

1.3.1.1芽孢杆菌活化培养 3

1.3.1.2纤维素酶基因组DNA提取 3

1.3.1.3电泳检测纤维素酶基因组DNA 3

1.3.2纤维素酶基因纯化回收 4

1.3.2.1引物设计 4

1.3.2.2 PCR扩增 4

1.3.2.3纯化回收DNA 4

1.3.3大肠杆菌质粒提取 5

1.3.3.1大肠杆菌活化培养 5

1.3.3.2质粒扩增 5

1.3.3.3质粒提取 5

1.3.4纤维素酶基因与大肠杆菌质粒双酶切处理 5

1.3.5大肠杆菌感受态细胞制备 5

1.3.5.1菌体的培养 5

1.3.5.2感受态细胞的制备 6

1.3.6纤维素酶基因和质粒的连接与转化 6

2.结果与分析 7

2.1纤维素酶基因提取 7

2.1.1基因组获取结果 7

2.1.2 PCR扩增结果 7

2.1.3纯化回收SL16基因 8

2.2大肠杆菌质粒提取结果 8

3.结论与讨论 9

参考文献 9

致谢 11

大肠杆菌表达异源纤维素酶

引言

纤维素材料是自然界中最丰富的可再生资源[1]。现代生物技术将纤维素原料转化为无污染的液体燃料乙醇，不仅可以作为一种新的资源，能为人类造福，缓解或解决化石能源燃烧造成的环境严重污染问题，而且可以实现农业剩余资源的高效利用，现在已受到世界各国的普遍关注[2-3]。纤维素是由葡萄糖组成的一种多糖，一般不溶于水及有机溶剂，是组成植物细胞壁的主要成分[4-5]。

纤维素酶是一类能降解纤维素并生成葡萄糖的酶的总称，在自然界中广泛存在 [6]。细菌、真菌和动物等体内都能产生相应的纤维素酶[7]。细菌纤维素酶从催化功能上可以分为三类：内切β-1,4-葡聚糖酶（endo-β-1,4-glucanase  EG）,随机水解非结晶纤维素内部的β-1,4-糖苷键，可以将长链的纤维素分子截成短链，并产生大量的非还原性末端的小分子纤维素；外切β-1,4-葡萄糖酶（exo-β-1,4-glucanase CBH）,又叫纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase）,从纤维素链状分子的末尾水解β-1,4-糖苷键，依次切下一个纤维二糖分子；β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase  BGL）,可以将纤维二糖或可溶性的纤维糊精水解成葡萄糖分子用于发酵生产其他生物产品[8-10]。

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验试材

大肠杆菌：大肠杆菌DH5α由周口师范学院发酵实验室保藏。

芽孢杆菌：四种芽孢杆菌WR2、WL11、SL16、LK1均由周口师范学院发酵实验室自主筛选并保存。