所谓的薄层色谱实际上是一种利用特殊氨基酸的检测来区分氨基酸种类的方法。它基于类似兼容的原则。对于薄层色谱测定,杰森等人经过反复实验
1、合成方法
GABA就是通常所说的氨基丁酸,其全称应该是为4-氨基丁酸,因为氨基丁酸有同分异构体,结构简式为NH2CH2CH2CH2COOH,摩尔质量为103.1。GABA水溶性特别好,与水以1:1的体积比互溶,但微溶于各种醇类溶剂,不溶于或难溶于乙腈和二氯甲烷等有机试剂,熔点较高,为195℃,在高于熔点温度或酸碱催化的条件下,脱去一分子水生成吡咯烷酮[14]。迄今为止,科学家们已经发明的GABA制备方法主要有化学制备法,微生物发酵法和植物萃取法[5]。
(1)化学合成法
化学合成法制备GABA产量低,成本高,在某些生产过程中甚至还会涉及到危险的有毒溶剂如乙腈和吡啶,对人体伤害较大,此外,反应可能并不完全,有残留物,所以应用范围有限,不能用于医药,食品等。目前化学制备方法主要包括以下几种方法 [2]
表 1.2 GABA 化学制备方法[2]
(2)微生物发酵法
所谓的微生物发酵方法是利用各种微生物如大肠杆菌,酵母菌和乳酸菌等培育出产率高,品质优良,状态稳定的菌落,并最终通过微生物发酵生产GABA。这种方法需要较高的生产器材和严格的环境要求,但对生物体的损害比化学合成要低。此法在食品和其他工业领域有着悠久的历史和广泛的应用,它不能用于食品和药品的生产。催化谷氨酸脱羧生产GABA具有收率高,成本低,安全等优点,已慢慢进入工业化生产阶段[7]。酵母菌由于其安全性和高效率等优点而属于食品级安全(GRAS)微生物,被公认为重要的对人体有益真菌,对于生产GABA有较大的价值和社会效益。酵母菌来源丰富,可以从米酒,各种发酵剂,泡菜和发酵水果果肉中分离出来。罗森等科学家在2001年开始研究用Lb.paracaseiFNRI7514制备GABA,最终成功制备了60g/L的GABA,大大提高了产率[4]。吴天和许士军等科学家发酵制备GABA,最后制得的GABA浓度高达250~500mg/100mL。黄志等由于其GABA含量高达78.37克/升[12],以前的记录再次刷新。
(3)植物富集法
所谓植物富集方法就是使用科学家们已经发明的技术分离和提纯含GABA的植物。与酵母菌等微生物发酵制备方法相比,对生产设备要求低,并且与化学合成法相比更环保和绿色化。目前,植物富集法制备GABA的常用方法主要有柱色谱分离制备和溶剂萃取方法。
A 柱分离制备法
所谓的柱分离制备方法和纸层析法类似,其原理是根据待分离样品中各个小分子组分在不同流动相中的分配系数不同,选择特定洗脱剂进行多次淋洗以实现色谱分离。温科等科学家尝试对黄曲霉发酵液进行分离淋洗,经过多番实验,选择了合适的树脂柱,最终制备提纯得到的GABA总产率高为48.7%[7]。还有一种特殊的柱分离制备方法,分离制备效果也不错,即活性炭吸附法,它具有发达的筛孔结构,这样就可以增加活性炭与材料接触的面积,产生较大的相互作用。例如,当从甘蔗尖端提取氨基酸时,首先把温度控制在35°C到85°C时,先用活性炭吸附,然后再加30%~90%二氯甲烷溶液,最后用0.5~2.0mol/L甲醇进行洗脱[9]。这种方法可以使原料反映材料使用的意义,提高反应的原子利用率,节省操作时间,减少有害物质的产生,减少对操作环境的影响。
B 溶剂萃取法
溶剂萃取法的方法不是很复杂,提取剂就是常见的水和酒精,利用溶解度的不同,将植物体内GABA提取出来,溶解到水与酒精中,再用旋蒸仪浓缩干燥就行了,大多数情况下化学萃取的产率比物理萃取产率高,萃取条件如下: 固体与液体比例为1:5-1:15比较合适,萃取温度为约25至95℃,并且提取时间为固定1.5至6小时或者超声25至75分钟,萃取2-4次较好,过滤后弃去滤饼,将滤液再重新用溶剂分离一下,如果要定性检测GABA就用茚三酮溶液,定量检测则需要选择其他仪器,如核磁,最后用旋蒸干燥即可得到氨基丁酸产品[15]。沉强等人利用水提取法成功地从茶中超声提取到GABA[11]。李梅西等人以土豆为原料,选用25%二氯甲烷为溶剂,物料与溶剂比为1:19(w/v),萃取时间1.5h,得到的GABA产率高达90%。用水或甲醇提取法是最常用的溶剂提取方法[20],其中,醇萃取法比水萃取法提取成本高,提取的产物中GABA含量低于水萃取法。另一种方法是用各种盐溶液或其它溶剂如甘氨酸–盐酸缓冲液,氨基硫羧酸,碳酸氢钠等提取GABA。李凤琴等人在萃取GABA就采用水提法,结果表面与醇提法相比,产率提高6.81%至8.34%,比硫酸水解法提高12.78%至13.69%[4],且方法稳定简单。王明等人试图从桑叶中提取GABA,该方法简单快速,使用离子色谱法时,可以消除由于萃取物质中含有水分而出现影响实验结果的各种杂峰[14]。但是,使用碳酸氢钠溶液时,要合理控制温度,因为碳酸氢钠高温下极不稳定,容易分解为碳酸钠和水。周华和李宗盛等人则使用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为介质,从水稻和小麦中提取出了GABA[7]。